引子合成常見問題與解答 (FAQ)
​

Q-1. 合成的引子是什麼形態？

A-1. 合成的 Oligo DNA 產品呈白色乾粉或無色透明，這都為正常形態。由於 oligo DNA 產品都是經過高速離心抽乾，所以在運輸的過程中由於顛簸容易使其脫離管底而全部或部分被附著於離心管壁或管蓋上，所以建議您使用前務必請先離心收集 Oligo DNA 製品於管底，然後再溶解 Oligo DNA 製品，以防損失而影響您的實驗。

Q-2. 如何對合成 DNA/RNA 製品進行定量?

A-2. 由於核酸在 260nm 附近有強吸收，因此根據此性質，用紫外分光光度計測定核酸溶液在260nm的吸光度值，據此對核酸進行定量，用 OD 值來表示。 1 O.D. 是指：置於光路徑長度為1cm的比色皿中的 DNA/RNA 溶液，如果其在 260nm 處的吸光度值為1，則稱1ml該溶液中溶解的 DNA/RNA 的量為1 O.D.。1 O.D.值的合成 DNA/RNA 的品質約為 33μg。

Q-3. 如何測定並計算OD值?

A-3. 將DNA/RNA溶液進行適當稀釋，使吸光度測定值與樣品濃度的關係在直線範圍內，再根據原溶液的總體積與稀釋倍數計算該溶液的總 OD 值。例如，一個 200μl 的 DNA/RNA 溶液，如果對其進行6倍稀釋，測定值為1.0 時，則該溶液的總 OD 值為：0.2 ml×6×1.0 OD/ml=1.2 OD。

Q-4. 如何保存合成的引子?

A-4. 乾燥製品很穩定，-20℃下可保存 2～3 年，甚至更長。 乾燥製品最好用 RNase-free 的 TE buffer (pH8.0) 或其它緩衝液溶解，用水溶解也可，但長時間存放時水溶液可能會變成酸性，促使引子降解。通常將引子配製成100 pmol/μl 的儲存液，分裝保存於 -20℃ 冰箱（每份反覆解凍最多5次)。使用前，將儲備液稀釋成工作液 (10pmol/μl或20pmol/μl)，剩餘部分於- 20℃ 保存。

Q-5. 引子在常溫下運輸，會降解嗎?

A-5. 不會降解，乾燥的引子在常溫至少可以穩定存放二週以上。而一般的運輸時間通常都在1-3 天，所以您收到的引子不會降解。

Q-6. 合成引子溶液在室溫下放置了數天，還可以使用嗎?

A-6. 溶液中的引子在常溫下放置3～4 天應該沒問題，但最好不要超過一個星期以上。其壽命受溶液中的菌體、核酸酶等的影響。

Q-7. 如何保存合成的螢光標記探針?

A-7. 螢光探針必須避光保存; 乾燥品可於-20℃ 保存一年以上;3)乾燥品可用無核酸酶的 TE(pH8.0) 或純水配製成高濃度溶液（儲存液，通常100pmol/μl），分裝數份保存於-20℃冰箱。使用前，將儲存液稀釋成工作液（10pmol/μl或20pmol/μl）後進行實驗。

Q-8. 製品溶解後發現有少許沉澱，會影響實驗結果嗎?

A-8. 所有的製品純化後都要進行去鹽，去鹽是使用 C18 管柱進行的，偶爾會有微量的樹脂溢出而進入製品。樹脂不影響任何反應結果，請簡單離心後取上清使用。

Q-9. 測定製品的OD值後發現A260/A280<1.8，製品品質（純度）合格嗎?

A-9. 由於核酸在 260nm 附近有強吸收，而蛋白質在 280nm 附近有強吸收，從生物體內萃取核酸時，常用A260/A280 比值來評價核酸純度（比值在1.8-2.0 之間），這一判斷是基於序列中 A、G、C、T 所占比例大致相同時的結果。而合成的 DNA/RNA 則不同，序列很短（通常在20-30 個鹼基之間），其中 A、G、C、T 各種鹼基所占比例很不相同，由於各種鹼基的摩爾消光係數 (Molar Extinction Coefficient) 不同（如下圖），因此不同鹼基構成的引子的 A260/A280 比值也不同，例如當序列中 C、T 鹼基的含量高時，該比值會遠低於1.8。 鹼基組成 A260/A280 100%A 2.50 100%G 1.85 100%C 1.15 100%T 1.14 A、G、C、T(各25％) 1.66 此外，序列中鹼基的排列順序也影響該比值。所以不能根據 A260/A280 比值來評估引子的純度。

Q-10. 能否根據電泳帶的亮度對合成的引子進行定量?

A-10. 不能。因為 EtBr 是透過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的引子為單鏈分子，只有透過自身回折(loop)，形成局部髮夾環結構( hairpin) 或鏈間形成部分雙螺旋結構 (hetero-dimer)，才能被 EtBr 染色。由於不同製品的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不同，所以不能根據 EtBr 染色帶的亮度來對合成的引子進行定量。

Q-11. 使用 3％ 的 Agarose 凝膠電泳合成的引子，發現有很多條泳帶，為什麼?

A-11. 引子的電泳一定要使用變性 PAGE 電泳。引子是單鏈 DNA，容易形成複雜的立體結構，因此進行 Agarose電泳時，容易出現多條泳帶（更無法用 Agarose 電泳進行定量）。

Q-12. 進行PAGE電泳時，長度完全一樣的引子為什麼泳帶不在同一位置?

A-12. A、G、C、T 的組成不同，電泳移動速度不同; DNA 的立體結構不同，電泳速度不同。這種情況在引子越短時越容易發生，長鏈引子之間差別較小。

Q-13. 投訴定量不準是怎麼回事?

A-13. 我們偶爾收到用戶投訴定量不準的報告，出現這種情況的可能性有： 生產人員定量錯誤。這種可能性有，但是不大，因為我們的生產人員都是經過嚴格的培訓，程式化規範操作和換算。公司內部的考核機制也使得分裝人員沒有必要故意少給用戶 OD 數，因為無論 OD 數是否達到訂單要求，我們都統計為工作量，沒有達到 OD 數的，分裝人員將清單及時回報到序列登錄部門安排重合就可以了。合成產量的高低是序列登錄部門人員的考核指標之一。一般情況下，引子都有留樣。接到使用者投訴後，我們都會找出留樣重新定量，一般都沒有問題； 分裝沒有問題，但引子抽乾或取樣過程中，引子乾粉可能意外丟失。這種情況很少見； 系統誤差，我們認為10% 左右為允許誤差。使用過程中，引子工作濃度範圍很寬，定量上的少許偏差不影響實驗； 用戶沒有能夠正確理解引子 OD 數的含義，沒有能夠正確使用分光光度計，特別是使用微量測定，使用者沒有將 OD 讀數，正確地轉換成原液中 OD 數。這種情況比較常見； 用戶收到引子乾粉時，打開引子管蓋前沒有離心或其他誤操作導致引子乾粉部分丟失。 例如，校正標準為 2 OD 引子量是否準確，簡單的做法是： 加入 1ml 水，徹底溶解混勻後，取 100ul, 加入 900ul 水，用光徑為 1cm 的石英比色管，波長 260nm，此時光吸收的讀數為 0.2 。

Q-14. 需要合成多少 OD 數?

A-14. 根據實驗目的確定。一般 PCR 擴增，2 OD 引子可以做 200-500 次 50ul 標準 PCR 反應體積。如果是做基因拼接或reannealing 後做連接，1 OD 就足夠了。做全基因構建的引子都比較長，片段越長 , 最後全長產率就愈低，出錯的機率就愈大。

Q-15. 如何檢測引子的純度?

A-15. 實驗室方便的作法是用 PAGE 方法。使用加有 7M 尿素的16% 的聚丙烯醯胺凝膠進行電泳。取 0.2-0.5 OD 的引子，用尿素飽和液溶解或引子溶液中加入尿素乾粉直到飽和，上樣前加熱變性 ( 95℃ ,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。 600V 電壓進行電泳，一定時間後 (約 2-3 小時)，剝膠，用螢光 TLC 板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用 EtBr 染色或銀染方式染色。

Q-16. PCR產物經克隆後定序發現，引子處的鹼基有錯誤，為什麼?

A-16. 如果定序後引子處出現了問題，不排除 PCR 錯配的可能，但更主要的原因應在合成引子本身。在引子合成過程中，除了人為將序列輸錯（可核對合成報告單），化學合成方法本身不可避免地會產生失敗序列(參見引子合成原理)，實際分析如下： 由於DNA 合成是從 3’-5’ 端一個鹼基一個鹼基地連接上去的，每連接上一個鹼基，都需要多步化學反應(Detritylation 、Coupling、Capping、Oxidation)，我們稱之為一個迴圈 (cycle)。Couping 是上一個鹼基的 5’OH與下一個鹼基的 3’ 活性部分發生偶合反應，該反應的效率最高可達 99％，即便如此，仍有1％ 的序列不能連接下一個鹼基，這些序列在經過 Capping 後脫離迴圈，成為缺鹼基的失敗序列; Capping 是將沒有連接上下一個鹼基的 5’-OH 乙醯化，阻止其進一步延伸。Capping 的效率不可能達到100％，沒有被 Cap 的 5’OH 會進一步發生反應，造成中間缺鹼基的失敗序列; Detritylation 是將上一個鹼基 5’OH 上的保護基脫去，準備連接下一個新鹼基，脫保護的效率也很難達到100％，沒有脫保護的 5’OH 會跳過該迴圈而直接進入下一個迴圈，造成中間缺鹼基的失敗序列; 在Coupling步驟中，新鹼基（活性狀態）在沒有與上一個鹼基發生偶合反應前發生自身連接，造成多鹼基的失敗序列; 合成時鹼基G可能會轉化成烯醇式異構體，PCR 擴增時被 DNA聚合酶識別為A，發生G to A的轉換。以上各種原因發生的失敗序列可經過純化，獲得不同程度地去除。對 40mers以上的 DNA 製品，PAGE 是最好的純化方法。所以，如您要對 PCR產物克隆後定序，一定要選擇 PAGE 純化或 HPLC 純化的引子。

Q-17. 引子是經過 PAGE 純化的，為什麼還有鹼基缺失或插入?

A-17. 理論上分析型 PAGE 變性電泳，可以區分引子之間一個鹼基的差別。但是製備 PAGE 電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，解析度便下降，電泳後切帶回收目的引子時，很難保証不切到僅幾個鹼基差別的引子。建議：您如果減少 OD 數，引子遇到的問題可能就會少一些。

Q-18. 為什麼 OPC 或 PAGE 純化的引子，再用 HPLC 鑑定純度不高?

A-18. 有些使用者引子需要純度特別高的引子，在使用前會以 HPLC 鑑定引子的純度，常常發現引子的純度一般70%左右。問題來了，還有那 30% 是什麼？引子經PAGE純化， 需要電泳，用緩衝液將引子浸泡出來，然後用 C18 濃縮，乙醇沉澱。沉澱得到的核酸物質基本是引子了，除此以外，還有其他一些非核酸類物質，他們一般不會干擾引子的作用。OPC 純化也有類似的情況。即使是 HPLC 純化的引子，如果對成品進行分析，一般也難達到很高的純度，引子都是由製備管柱而來，peak 經過濃縮抽乾，部分非核酸物質被收集。

Q-19. 進行蛋白質表現實驗數個月不成功，經定序發現引子處有錯誤，怎麼辦?

A-19. 表達實驗之前一定要對 DNA 序列進行驗證; 我們可以免費重新合成引子; 如進行索賠時，按國際行業慣例，索賠範圍限於製品價格範圍之內。

Q-20. 引子不純會有什麼後果?

A-20. 引子不純可能會導致： 1) 非專一性擴增； 2) 無法用預先設計在引子 5' 端酶切位點的酶切開，特別是沒有保護鹼基的引子； 3) 用於定序出現雙峰或亂峰。解決辦法：重新合成或重新純化。

Q-21. 已經溶解的引子，為什麼原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了?

A-21. 如果您溶解引子的水 pH 過低或污染了菌或核酸酶，會使引子降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引子加入量不準確。建議分裝引子，避免反覆解凍。建議使用 10mM Tris (pH7.5) 緩衝液溶解引子，因為有些蒸餾水的 pH 值比較低（ pH4-5 ），引子在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引子沒有問題，而是 PCR 使用材料特別是範本的品質與先前使用的不完全一致。

Q-22. PCR 擴增不出就引子有問題嗎?

A-22. 基本不是。當今發展出各色各樣的 PCR 擴增技術，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決 PCR 擴增中遇到的擴不出，擴增效率低的問題。如nest PCR 就是擴增那些拷貝數很低的基因片段。有些重複片段的擴增，GC 含量高的片段，非要採用特殊擴增手段才能擴增出了。 引子擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見 RT-PCR 。請注意，很多基因通過常規 RT-PCR 方法是很難不增出來的。 RT-PCR 成功的關鍵在於 RT 的反應的 RNA 品質和目標基因在特定組織和細胞中含量。 從基因組中擴增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為範本需要嚴格控制用量。基因組DNA 過高，會影響反應系統中的 Mg2+ 和 pH值。

Q-23. PCR 擴增有很強的非專一性條帶，說明引子有污染嗎?

A-23. 不能。擴增目標很弱或沒有，倒是非專一性條帶很亮，說明引子不純或有污染? 事實上，我們曾分析過一些非專一性條帶，定序發現在這些非專一性片段的兩端可以發現一條引子序列。我們只能說非專一性擴增一般是 template污染（如 RNA 中污染基因組）或擴增條件不合適所致。

Q-24. 需要什麼級別的引子?

A-24. 引子常用的純化方式 OPC 純化，PAGE 純化，HPLC 純化。根據實驗需要，確定訂購引子的純度級別。 應用 引子長度要求 純度級別要求 一般PCR擴增 < 40 mers OPC 一般PCR擴增 > 40 mers PAGE 診斷PCR擴增 < 40 mers OPC，PAGE DNA定序 20 mers左右 PAGE 亞克隆，點突變等 根據實驗要求定 OPC，PAGE，HPLC 基因構建（全基因合成） PAGE 反義核酸 PAGE 修飾引子 PAGE，HPLC

Q-25. 如何才能保證引子的正確性?

A-25. 合成引子時，選用高純度製品。 避免使用大於 50mers 的長鏈引子，最好選用小於35mers的引子。 進行克隆實驗時，每次克隆都須進行定序驗證，以確保序列的正確性，然後再進行下一步實驗。進行蛋白表達實驗時，尤其需要注意。

Q-26. 我們可以合成多長的引子?

A-26. 可提供合成引子的長度為2-100 個鹼基，當合成的引子序列較長時，由於合成及純化方法的限制，很難保證製品中每個序列都正確無誤。此外，100-130mer 的長鏈引子合成起來比較困難，序列過於特殊時我們可能無法合成。

Q-27. 為何長鏈引子收費要比短鏈引子高?

A-27. 長鏈試劑的加入量要比短鏈引子要多很多，尤其是大於 90mers 的鹼基以上的引子，由於成本的增加，從而導致價格也相應提高。

Q-28. 長鏈引子為什麼出錯的幾率非常高?

A-28. 引子合成時，每一步反應效率都不能達到 100%，產生鹼基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引子越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引子萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如 PCR 擴增，不可能絕對保證擴增產物中沒有突變，引子合成也不可能保證 100% 正確。要知道，引子合成中發生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真耐熱聚合酶 PCR 擴增過程所產生的頻率都要高。

Q-29. DNA合成粗產物中含有什麼雜質?

A-29. DNA 合成儀合成的粗產物，其中除了含有所需的目的 DNA 片段以外，還含有合成反應過程中產生的目的片段短的失敗片段以及去保護基團產生的銨鹽，本公司提供的引子已全部通過純化去除短片段、通過脫鹽 (desalting)去除鹽分。

Q-30. 一般合成的引子的 5’ 和3’ 末端有磷酸基團嗎?

A-30. 沒有，5’ 和 3' 末端均為 -OH 基。如需要加磷酸基團，訂貨時請特別註明，此時需收取磷酸化（PO4修飾）的費用。

Q-31. 平端的 PCR 產物難以克隆，為什麼?

A-31. 由於一般的 PCR 用引子的 5’ 末端都沒有磷酸基團，因此，擴增後的 PCR 產物的 5’ 末端也沒有磷酸基團。當克隆於去磷酸化的末端平滑載體時，無法克隆進去；而當克隆於非去磷酸化的末端平滑載體時，背景會極高。此時請對PCR產物的5’端進行磷酸化（PO4修飾）化處理。

Q-32. 合成的引子進行PCR 反應時無目的帶，怎麼辦?

A-32. PCR反應失敗的原因很多，可以從以下幾個方面考慮。 引子設計是否合理？引子和範本是否配對，同源性有多大？ 引子本身是否有立體結構，或者二條引子之間是否形成高級結構？ PCR 反應用試劑是否能正常工作？ PCR 儀是否工作正常？ PCR 反應條件是否合適？ template 是否存在複雜結構：GC含量高、重複序列等？ 如果一切正常，還無法解決問題時，我們願意免費重新合成引子。

Q-33. 進行反義核酸實驗時，是否要對DNA鏈全部進行S代修飾，除了S 代外，還有什麼辦法可增加核酸在生物體內的穩定性?

A-33. DNA 經 S 代修飾後比較穩定，在細胞中不會被核酸酶降解。如果整條鏈全部S代，的確能增加DNA的穩定性，但會降低其 Tm 值，也即降低該反義 DNA 與靶序列的結合效率。因此，科研人員一般採用將DNA片段兩端插入數個（通常3個）S 代磷酯鍵（Phosphorothioated Bonds），這樣既能增加DNA的穩定性，又能增加反義DNA與靶序列的結合能力。不過如果要將反義DNA注入到活的動物體內，為增強穩定性，還是將整條鏈S代效果更好。2’O-Me RNA也抗核酸酶降解，可與S 代 DNA 構成嵌合的反義核酸，這樣既能增強反義核酸的穩定性，又能增加其與靶序列的親和力。此外，5-Me-dC 由於能增強 DNA 雙螺旋的穩定性，有時也被滲入到S代的反義核酸中。

Q-34. Biotin 標記有三種，它們之間有何不同?

A-34. ss-Biotin 可提供比較長的連接臂（臂長約24.3A)，有利於Biotin與Avidin間的結合，而且分子中含有s-s鍵，可使用還原劑 (50mM DDT 或 100mM 巰基乙醇)方便地將探針分子(不再帶有Biotin基團)與靶序列分開。Imino-Biotin可提供較短的連接臂（約13.5A)，其最大特點是 Biotin 與 Avidin 的分離可在較溫和的條件下進行：8M鹽酸胍（pH4.0)。普通的Biotin 提供的 ss-Biotin 相似長度的連接臂，但只能用 8M 鹽酸胍 (pH1.5)分離 Biotin 與 Avidin。

Q-35. FITC、6-FAM、5-FAM 標記之間有何區別?

A-35. 它們皆是螢光素標記(Fluorescein)，三者結構間的區別如下：5-FAM 與6-FAM 互為異構體；而 FITC 則在引子的連接方式上（硫尿素鍵）有別於前者（醯胺鍵），但它們的發色團均為螢光素，通常使用上沒有區別。

Q-36. Quencher基團為 TAMRA 或 ECLIPSE 的雙標記螢光探針在使用上有什麼不同?

A-36. 有Quencher基團 TAMRA 或 ECLIPSE 組成的雙標記螢光探針常常被用作水解探針(Hydrolysis Probes)，或稱“Taqman” 探針，用於Real-time PCR 實驗。由於TAMRA與ECLIPSE光譜學性質不同，作為Quencher基團使用時的特點也不同，現說明如下： TAMRA 為螢光染料，用於 Quencher dye，自身會在更高波長處發射螢光，此發射螢光會對reporter dye的偵測造成影響，探針螢光背景相對較高。而 ECLIPSE 為非螢光染料Quencher報告基團，且自身不發射螢光，因此，探針螢光背景低，信躁比(signal/noise ratio )更大，偵測靈敏度更高。 Quencher 基團對報告基因的Quencher有賴於二者的光譜交錯(Overlapping)，也即 reporter dye 的螢光波長應落在Quencher dye的吸收光譜波長範圍內。對比TAMRA與ECLIPSE的吸收光譜可見，TAMRA 的吸收光譜波長範圍窄，與之可匹配的 reporter dye 種類比較少，而ECLIPSE具有更寬的吸收波長範圍(390nm-625nm)，可滅的 reporter dye種類很多 (FAM、HEX、TAMRA、ROX 等均可)，用於多重PCR（Multiplexing PCR）時，能有多種選擇。因此 Quencher基團為 ECLIPSE 的雙標記螢光探針更適合於多重 PCR。

Q-37. 如何計算引子的 Tm 值?

A-37. Tm 值：DNA 熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結構降解一半時的溫度，亦即DNA 變性過程中，紫外吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為 DNA 的解鏈溫度(Tm) . Tm值的計算方法：粗略計算可以用簡單公式：Tm = 4℃ ( G + C )+ 2℃ ( A + T ) 但這個公式只適用於14~20 個鹼基的引子，引子的 Tm 值還與引子長度、鹼基組成、引子使用緩衝溶液的離子強度等有關，我們採用以下計算方法：長度為 20mer 及以下的引子，Tm計算公式為： Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 對於更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為： Tm = 0.41(% of GC) – 675/L + 81.5 。

Q-38. Primer 設計的基本原則是什麼?

A-38. 引子設計的下列原則供您參考。 引子長度一般在 18-35mer 。 G-C 含量控制在 40-60% 左右。 避免近 3' 端有酶切位元點或髮夾結構。 如果可能避免在 3' 端最後 5 個鹼基有2個以上的 G 或 C 。 如果可能避免在 3' 端最後 1 個鹼基為 A 。 避免連續相同鹼基的出現，特別是要避免 GGGG 或更多 G 出現。 annealing溫度 Tm 控制在 58 -60℃ 左右。 如果是設計點突變引子，突變點應盡可能在引子的中間。

Q-39. TaqMan 探針設計時應遵循原則?

A-39. 探針應位於兩引子之間; 探針中鹼基G、C 的含量應在 20％-80％ 之間; 避免同種鹼基成串出現，特別是鹼基“G”; 鹼基 G 不要出現在 5’ 末端; 探針的 Tm 值要比引子的 Tm 值高8-10℃，應在68-70℃之間; 探針長度超過 30 個鹼基時，最好把 Quencher 基團放在中間，以防止螢光背景過高，這時探針的 3’ 末端應加磷酸基封阻，以防探針延伸。

Q-40. 引子（含修飾）的分子量是如何確定的?

A-40. 非修飾的引子的 Molecular Weight 在隨引子提供的報告單上都有明確的標示。如果需要估計一個引子的分子量按每個鹼基的平均分子量為324.5，引子的分子量=鹼基數 X 鹼基的平均分子量。或按下列公式計算MW= (NA * WA) (NC * WC) (NG * WG) (NT * WT) (Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx） ( Ni* Wi) 16* Ns– 62. NA, NG, NC, NT, Ni分別為引子中鹼基A或G或C或T或I的數量，WA, WC, WG, W, Wi 分別為引子中鹼基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分別為修飾基團的數目和分子量。 對於混合鹼基的分子量為混合鹼基的分子量總合除以混合數，例如G A 混合的分子量為（313.21 329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數目，硫代每個位置增加分子量16。 常規鹼基分子量 Base Molecular Weight A 313.21 C 289.18 G 329.21 T 304.19 I 314.2 U 290.17

Q-41. 最長可以合成多長的引子?

A-41. 引子越長，出現問題的概率就越大。我們合成過120mers的引子，但是產率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過100 mers，按照目前的引子合成效率，80mers的粗產品，全長（還不一定正確）引子的百分比不會超過40%，後續處理還有丟失很多，最後的產量是很低。